中华耳科学杂志,年18卷3期
共培养技术在耳软骨再生中的应用及展望
林阳洋潘博
小耳畸形的治疗是整形外科的重点和难点，在我国发病率约为3.06/[1]。目前有三种耳廓重建方法:自体移植物，人造移植物和外部假体移植。然而，自体肋软骨雕刻难度较高，且可造成胸廓畸形;而人工支架植入可有感染、移植物排斥和外露等风险。需要更好的耳廓重建方案[2]。组织工程制作耳廓软骨植入物，可以避免上述风险，应用前景广阔。种子细胞是组织工程技术中所用到的所有细胞的总称。如何获得足量的耳廓软骨种子细胞（AuricleChondrocytes，AuCs）进行组织工程耳再造仍有待进一步研究。间充质干细胞（MesenchymalStemCells,MSCs）可以分化成软骨细胞，作为软骨工程种子细胞的替代来源。单独培养转化软骨细胞或MSCs需要较长的时间，增加了感染的风险，分化方向难以控制，常伴有肥大，继而钙化，导致力学性能不佳。所以单一使用软骨细胞或MSCs目前对头颈区域的基于细胞的软骨修复并不理想[3]。面对细胞单独培养的困境，软骨组织工程提出了共培养体系。本文对共培养体系在软骨再生中的应用进行了全面的综述，并比较了直接共培养体系和间接共培养体系的差异，讨论了其潜在的机制及新的进展。共培养研究在关节软骨（ArticularChondrocytes，ACs）等生物工程领域得到大量应用，相应的进展给耳廓软骨生物工程带来很多启发。
1共培养体系
共培养体系即是建立类似于体内环境的培养体系，尽可能使体外环境与体内环境相吻合，从而使细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖，在细胞培养技术的基础上发展出了细胞共培养技术。而细胞共培养技术是将2种或2种以上的细胞共同培养于同一环境中，由于其具有更好地反映体内环境的优点，所以这种方法被广泛应用于现代细胞研究中。传统软骨组织工程以自身软骨细胞作为种子细胞，存在来源不足等问题，限制了其临床应用。近年来，多种来源的干细胞因其较强多向分化潜能、易从身体不同部位大量获取等优点，成为软骨组织工程种子细胞的新来源。基于干细胞的共培养体系给软骨组织工程研究提供了新的方法。
共培养体系可以获得充足的软骨工程种子细胞数量，具有减少软骨细胞的去分化等明显的优势。然而，大多数关于共培养的研究是基于颗粒或微量培养的ACs，对MSCs/AuCs共培养和共移植软骨形成的研究还很少。Dlk1在成年猪AuCs中强烈表达，表明成熟AuCs与关节软骨中增殖/前增生性区域的ACs处于相似的状态[4]。ACs共培养的研究成果可能为工程耳软骨的临床转化提供有希望的策略。
组织工程再生耳至少需要1.5亿个AuCs，但最初只能分离出万个AuCs。尽管AuCs增殖稳定，但在重复单层传代过程中，软骨细胞表型和能力迅速丧失，这是一种常见的去分化现象，很难避免。最终，去分化导致纤维软骨形成，其功能远不及透明软骨。Zhang等人利用小耳畸形耳廓软骨细胞和牛MSCs共培养发现，尽管小耳畸形耳廓软骨细胞有很强的增殖能力，但是在3代以后的单独重复传代中，其成软骨能力迅速丧失[4]。
研究如何在获取充足的软骨种子细胞数量的同时避免或减少去分化程度对耳廓软骨组织工程具有重要意义。关于MSCs在共培养介导的软骨形成中的作用和机制，目前有两种观点。一个观点是MSCs可由软骨细胞诱导并可直接转化为软骨细胞样细胞，通过骨髓MSC（bMSCs）标记、transwell分离共培养、软骨细胞条件培养基等多种方法得到证实；另一个观点是MSCs可以通过营养效应促进软骨细胞的增殖和软骨特异性（extracellularmatrix，ECM）的产生。因此，这两种机制很可能是共存的，MSCs和软骨细胞可能是相互协同的。共培养对软骨形成的作用机制尚未完全阐明。为了探讨细胞间在共培养体系中的相互作用、可行性和有效性，JianyuZou等[5]提出了两种共培养体系，即直接共培养体系和间接共培养体系，有助于揭示共培养体系在软骨再生中的机制，为共培养体系在软骨组织工程中的应用提供了理论支持。通过共培养策略建立基于MCs和干细胞的、成本更低、软骨形成更稳定的软骨组织再生技术，可以为工程人耳软骨组织的临床转化提供一种促进策略。
2直接共培养体系与软骨再生
直接共培养体系是将两种或两种以上的细胞均匀混合，不同来源的细胞密切接触，通过表面受体和分泌的各种细胞因子相互作用。直接共培养体系可以进一步分为单层直接培养（细胞直接混合），以三维直接培养（包括支架或水凝胶共同培养）。与单层培养相比，三维培养能较好地维持软骨细胞的自然表型[6]。近年来，利用水凝胶颗粒作为共培养支架成为研究热点。软骨细胞-软骨细胞共培养，以及软骨细胞-间充质干细胞共培养，前者研究较少，研究主要集中于软骨细胞和MSCs的结合。
2.1直接共培养体外研究
大多数ACs可以被bMSCs替代，缓解软骨细胞分离和扩张带来的问题。无论去分化处于哪个阶段，在合适的诱导培养基中，去分化牛ACs细胞与兔bMSCs共培养均可产生软骨形成[7]。与单一培养相比，共培养的牛ACs和兔bMSCs对TGF-β3有更高的敏感性[8]。与MSCs共培养时，软骨细胞表型更加稳定，ColII、糖胺聚糖和转录因子Sox9增加[9]。共培养显著减少了所需的软骨细胞数量，增强了MSCs的软骨形成，减少了体外增殖过程中的去分化，避免了纤维软骨的形成[10]。两种细胞类型之间的密切接触是共培养的先决条件，这种相互作用改善了受体MSCs的生存能力、软骨形成、基质形成和稳态。细胞内的内容物从共培养的软骨细胞向向邻近的MSCs转移，而抑制胞外囊泡(EV)转移阻碍了共培养的协同作用，EV可能是这些共培养中主要的交流方式[11]。
很多实验研究
